Lnab frukost

Uttrycket av SDEA i teststammarna undersöktes med hjälp av immunoblotting i bottenpanelen. De visade uppgifterna var representativa för tre oberoende experiment utförda i tre exemplar med liknande resultat. Uppgifterna presenteras som ett genomsnittligt sem för en miljon. P-värdena beräknades med hjälp av ett tvåvägs T-test T-test. En bild i full storlek för att bestämma lnabs roll under L.

Vi undersökte också fördelningen av LNAB i celler infekterade med L. Dessa resultat tyder på att lnab, liksom MAVL, troligen verkar på ytan av bakteriefagosomen. I likhet med tidigare experiment, i celler infekterade med L. vild typ L. omvandlingen av Pr-UB och ADPR till nativt ubiquitin antyder att ackumuleringen av dessa ubiquitinderivat stör intracellulär replikation av L.

vi undersökte tillväxten av relevant L. Enligt resultaten från en tidigare studie 27, lnab-deletion påverkade inte detekterbart intracellulär bakteriell replikation Fig. Det är viktigt att notera att tillväxtdefekten kan kompletteras med uttrycket av LNAB, men inte av dess enzymatiskt inaktiva mutant. Fig. Tillsammans tyder dessa resultat på att ackumuleringen av PR-UB i värdceller är skadlig för lnab frukost intracellulära bakterietillväxten, och effekterna blev allvarligare när uttrycksnivån.

av parterna som SDEA har det ökat i bakterier, och att LNAB förbättrar sådan exponering genom lnab frukost eliminera den i infekterade celler. Dessa resultat etablerar LNAB som ett enzym som katalyserar spaltningen av ATP i positionen för XX-fosfat för att överföra förstärkarfragmentet till fosforylgruppen i PR-UB och sidokedjan av tyrosinrester.

Proteinband motsvarande LNAB från dessa reaktioner analyserades för att identifiera modifierade rester med masspektrometri. LNAB eller dess mutanter inkuberades med 32P-XX-ATP och aktin, och produktionen av ett självmodifierat protein detekterades med hjälp av en autoradiograf B. De röda pilarna indikerade ampylerade proteiner. Hemligt utspädda celler av jäststammar som uttrycker dessa toxingener eller deras s-HXXXE-mutanter detekterades på ett medium innehållande glukos eller galaktos.

Bilderna erhölls efter en 3-dagars inkubation vid 30 oc till vänster. Proteinuttryck studerades genom immunoblotting med en flagg-specifik antikropp. Fosfoglyceratkinas PGK har undersökts som en belastningskontroll. För de fem studerade toxinerna upptäcktes självmord lätt för ett toxin från Burkholderia Ambifaria TBA och ett toxinfragment från Edwardsiella Iktaluri Tei Fig.

Dessutom fann vi att TEI och TBA var giftiga för jäst, vilket kräver orörd. S-HXXXE motiv fig. Frånvaron av toxicitet av andra testade toxiner har visat att deras cellulära mål saknas i jäst eller att lnab frukost mål inte är nödvändiga för jästens livskraft. Strukturell homologi lnab-sökningen med DALI-servern gav inga signifikanta träffar, vilket tyder lnab frukost att detta är ett nytt vikprotein.

Intressant är att Lnab frukost, H och e, de tre lnab frukost som är kritiska för katalys, bildar en kontinuerlig plattform belägen i regionen som koncentrerade den positiva elektrostatiska potentialen Fig. De övre panelerna presenterar schematiska diagram över områdena för organisering av lnab-och aktindomänerna. Den nedre panelen visar den binära strukturen av LNAB-aktin.

Lnab-och aktindomänerna färgades enligt den övre delen av diagrammen. Gränssnitten som är involverade i lnab-aktininteraktioner markerades i två prickade cirklar. LNAB och actin visades som orange respektive gröna Tecknade filmer. Rester som är viktiga för bindning visades i form av aktinpinnar i grönt och LNAB i orange. Vätebindningar lnab frukost markerade med blå prickade linjer.

Proteiner i reaktionerna detekterades genom CBB-färgning. Aktin detekterades med användning av anti-aktinantikroppar och proteiner detekterades med användning av CBB-färgning. LNAB visades i en grå ytmodell. Rester som potentiellt är involverade i ATP-bindning indikerades som orange pinnar. ATP visades som en blå ballongmodell, och vätebindningar representerades av blå prickade linjer g.

Proteiner detekterades med hjälp av CBB H-färgning. Den konstanta bindningskonstanten Lnab frukost beräknades med hjälp av Nanoanayze-mjukvarupaketet. De visade uppgifterna är representativa för tre oberoende experiment med liknande resultat e, f, h och i. Bild i Full storlek två lnab-regioner är i direkt kontakt med aktin genom omfattande polära och hydrofoba interaktioner: en lång slinga bestående av ett par antiparallella XVI-ark, ett proximal s-HXXXE-motiv och en karboxylhelix a18, som vi betecknar som Gränssnitt 1 respektive gränssnitt 2.

Mutationen av en enda substitution på andra platser som är involverade i dess interaktion med aktin påverkade emellertid inte dess enzymatiska aktivitet på ett detekterbart sätt. Ris. Till skillnad från enzymer som endast riktar sig mot de hydroxylhaltiga sidokedjorna i deras substrat, riktar sig LNAB mot fosfatgruppen i Pr-UB. Det har visats att FIC-domänen använder CDP-kolin 34 och UTP 35 som reagens, det är möjligt att vissa s-HXXXE-proteiner kan använda andra nukleotider eller deras derivat som substrat för proteinmodifiering.Ampilering är en reversibel modifiering, signalering genom denna mekanism kan moduleras av specifika stimuli 36, 37, och är av stort intresse för att identifiera enzymer som är involverade i förändrad ampilering katalyserad av dessa olika modifierare.

Behovet av en cellspecifik värdcell gör det möjligt för patogener att begränsa aktiviteten hos virulensfaktorer i målceller. Till exempel använder både Bacillus anthracis edema factor och Cyaa av Bordetella pertussis 39, 40 camerulin cam som en kofaktor för att säkerställa att cAMP genereras endast i värdceller. PR-UB hittades endast i celler infekterade med L. Våra resultat lyfte fram vikten av ubiquitin homeostas i L.

infekterade celler. Orsaken till aktins behov av lnab-aktivitet är dock mindre tydlig. Aktinberoende kan förhindra ATP-utarmning inducerad av LNAB, eller aktiv LNAB kan känna igen fosforibosyl-bärande metaboliter i bakterieceller. Alternativt kan bindning till aktin underlätta inriktningen av värdproteiner i relevanta cellulära processer, såsom NFkB-signalering.

Ytterligare undersökning av den katalytiska mekanismen för LNAB, funktionen av toxiner i denna familj och den potentiella användningen av s-HXXXE-motivet av eukaryota celler i signalering kommer att leda till förståelse inte bara proteinbiokemi utan också nya kaskader av cellsignaler som är potentiellt viktiga för utveckling. och sjukdomen. Modifiering av modifieringen erhållen av PR-UB, som omvandlas till naturligt ubiquitin genom successiva reaktioner katalyserade av LNAB och MAVL.

Mediemetoder, bakteriestammar, plasmidkonstruktion lnab frukost Escherichia coli-cellinjer odlades på plattor med LB-agar eller i lb-buljong. LP03 är en isogen mutant DOTA mutant saknar MAVL eller LNAB, skapades med användning av lp02 stammen, eftersom de tidigare beskrivna komplementära plasmider byggdes genom att införa genen av intresse i PZL plasmid för uttryck av 3XHA-UB i däggdjursceller beskrevs tidigare 6.

Integriteten hos alla strukturer verifierades genom sekvenseringsanalys. Alla däggdjurscellinjer kontrollerades regelbundet för potentiell mykoplasmaförorening med universal mycoplasma detection kit från ATCC Cat K. I varje fall lades sekvenskodningen för flaggmärket till genens aminoterminala ände för att underlätta detektering av genuttryck.

De resulterande plasmiderna infördes i jäststammen W 46. Tio mikroliter av 5-faldiga utspädningar av mättade kulturer hittades i ett kasserat medium innehållande glukos eller galaktos. Plattorna inkuberades vid 30 oc i 3 dagar före avbildning för att bedöma tillväxten. Transfektion, infektion och immunoprecipitation plasmider transfekterades till däggdjursceller med användning av lipofektamin-invtetrogen, och vid behov utfördes immunoprecipitation med lysater av transfekterade celler med användning av flagg-specifika antikroppar associerade med agaros, agaros i kombination med Cytiva proteinbollar, katt vid 4 JJ C i 8 timmar.

Pärlorna tvättades 3 gånger med en förkyld lysbuffert. För intracellulär tillväxt av L. bakterier, infekterade celler lyserades från 0. Fyra timmar före infektion tillsattes iptg till buljongen vid en slutlig koncentration av 0. Trettiosex timmar efter transfektion användes opsoniserade bakterier för att infektera transfekterade celler i mina lysater centrifugerades två gånger vid 20 JJ under 15 minuter och supernatanterna samlades in och inkuberades Anti-ha-pärlor vid 4 JJ under 8 timmar.

Granulerna tvättades tre gånger med en kall lysbuffert och kokades i en 1-faldig provbuffert i 10 minuter. För att upptäcka Pr-UB i celler infekterade med L., fick reaktionerna äga rum i 2 timmar vid 37 XJC, och sedan inkuberades proverna med anti-ha-pärlor för 3xha-UB immunoprecipitation genom inkubation vid 4 XJC i 8 timmar. Intracellulära och vanliga bakterier kännetecknades av konsekvent immunfärgning.

Proverna kontrollerades och analyserades med hjälp av ett Olympus IX-blommmikroskop. Proteinuttryck inducerades från 0. Bakterieceller samlades in genom centrifugering och lyserades med ultraljud. De lösliga lysaterna renades genom rotation vid 15 JJ. g vid 4 JJ. C i 30 minuter. För att rena proteiner för strukturell studie, kodningsregioner eller muterade populationer av MAVL eller LNAB infördes i PET28A-Sumo, och de resulterande plasmiderna var var och en i E.

bakteriestammar odlades vid 37 XVI C i LB buljong på en RPM rpm shaker och inducerades sedan från 0. Bakterierna odlades sedan i 16 timmar vid 18 xnumx C, och sedan samlades cellerna genom centrifugering xnumx g, 15 min. Proteinkoncentrationen mättes i A och beräknades med hjälp av deras teoretiska utrotningskoefficienter. Koncentrationen av ADPR i sprutan var 1 mM och koncentrationen av proteiner i provcellen var 0.

Tjugofem på varandra följande 2 xnxl-injektioner av ADPR titrerades i en xnxl-provcell med ett intervall S mellan injektioner med användning av en blandningshastighet av RPM. Sangon Biotech actin, a erhölls i samma buffert i en koncentration av 22 mikron.Titrering fastställdes för 20 injektioner, var och en av 2 xnxl med s-intervall, med undantag för den första injektionen av 0.

Prover togs vid de angivna tidpunkterna. De röda pilarna anger bandets identitet. Medelvärdena för XX SD representerar tre oberoende biologiska upprepningar av oparade tvåsidiga t-tester; p-värdet är 0. Dessutom testades defosforylering med användning av PHOS-TAG SDS-PAGE Dodecylsulsulsulfat Polyakrymidgelelektrofores, baserat på minskad migration av fosforylerade proteiner FIG. LEM3 är således en dålig fosfatas, trots den uppenbarligen höga strukturella likheten i och runt den aktiva platsen.

Förutom Rab1b kan Rab35 också fosfokoliseras in vitro från ANKX. Dessutom är de nästan strukturellt identiska, eftersom superpositionen av Rab1b och Rab35 leder till RMSD 0. Även om Rab35 är fosfokoliserad i en homolog position, är T76 modifierad i Rab35 istället för S76 observerad i Rab1b. Intressant nog kan LEM3 inte klyva PC-gruppen från treoninhaltiga kaniner i.

Slutligen kan LEM3 avlägsna olika fosfomonoester-eller fosfodiesterbindningar av serin, men inte treoninrester. Specifikt för deltagande av LEM3-komplex: Rab1b-strukturen och funktionell analys av LEM ger grunden för en katalytisk mekanism som liknar PPM-fosfataser. För att ytterligare karakterisera den strukturella grunden för att känna igen RAB1BS76-datorer försökte vi få sin komplexa struktur med LEM på grund av den övergående karaktären av deras interaktion, var den gemensamma kristalliseringen av proteiner misslyckad.

Därför använde vi en platsspecifik kovalent bindande strategi för att fånga LEM3:Rab1b-komplexet. Vi tillämpade ett tidigare etablerat förfarande som använder ett CDP-kolinderivat som bär en tiol-reaktiv kloroacetamiddel på kvartär ammoniumbunden via en C3-länkare som kallas CDP-kolin-CL. beläget i omedelbar närhet av det katalytiska centrumet i. För att minska den spontana klyvningen av fosfodiesterbindningen med LEM3 introducerade vi dessutom DALEM3-mutationen, vilket signifikant minskade den hydrolytiska aktiviteten, men påverkade inte rening, Fig.

Förekomsten av flera arter beror troligen på en icke-specifik reaktion med cystein LEM3. Detta gjorde det möjligt för oss att utnyttja lem3: s oförmåga att klyva fosfat i treoninrester och därigenom erhålla ett komplex med brist på hydrolys. Dessutom kan kommunikation via Cyslem3 leda till suboptimal positionering av Rab1b vid den komplexa gränsen, vilket indikeras av låga totala komplexa utgångar.

Följaktligen har vi introducerat ytterligare cysteinsubstitutioner vid den förmodade LEM-aktiva platsen för att förbättra avkastningen. Ris. Den intakta MS bekräftade den komplexa renheten och identiteten. Således påverkar mutationer inte den övergripande strukturen hos LEM3 eller placeringen av aminosyror inom den aktiva platsen, även om mindre snedvridningar kan uppstå som orsakar en minskning av aktiviteten.

Complextc-kristaller diffrakterade till 2. Naturlig CDP-kolinsvart, utrustad med tiol-reaktiv funktionalitet av kloroacetamid, separerad från kolingruppen med den röda C3-länkaren. Den röda pilen indikerar körfältet för ett specifikt komplex. Proverna kördes på samma gel, den svarta ramen indikerar skärning. ANM, absorption i nm. Elektrondensiteten gjorde det möjligt hur träna som gravid konstruera proteinkedjor på en hög detaljnivå, särskilt vid gränssnittet, där densitet observerades för de anslutna aminosyrorna T76RAB1B och CLEM3 och PC-C3-gruppen Fig.

Den svaga elektrondensiteten lnab frukost de höga B-faktorerna för länkaratomer indikerar emellertid strukturell flexibilitet, ytterligare Fig. Därför tvingar den kovalenta länkaren förmodligen inte Rab1b och Lem3 till artificiella konformationer av en ytterligare figur. För länkarregionen är C3 inte synlig, medan L68LEM3 visar en hydrofob interaktion med kolingruppen, Fig.

Metalljoner representeras som sfärer av mörkgrå. Platserna för hydrofoba fläckar är markerade i rött.

Interaktionen mellan aminosyror visas i form av pinnar. Rörelsen i rymden orsakad av LEM3 indikeras som en prickad linje och mäts i Xnxngstr Xnxm. Substitutionen av aminosyror LEM3 F70Arab1b indikeras av svarta pilar. Positionerna för aminosyrorna LEM3 i LEM-strukturen visas som sfärer av ljusgrön, och deras motsvarande position i den komplexa strukturen visas som en sfär av mörkgrön.

En fullstor bildöverläggning av Complextc och Rab1b-obundet LEM3 avslöjade en andra aminosyra som potentiellt är involverad i samordningen av kolingruppen. På grund av modifieringen av TLEM3 till cystein för kovalent bindning observeras inte interaktionen i själva komplexa strukturen, men vid ersättning av grädden till CLEM3 med naturliga treoniner på spetsarna under den hydrofoba interaktionen mellan metylgrupperna i kolingruppen och TLEM3.Tillsammans möjliggör L68LEM3 och TLEM3 bildandet av en hydrofob miljö som främjar korrekt anpassning av kolingruppen i den katalytiska platsen.

Fosfatfragmentet av länkaren i Komplextc deltar inte i direkt interaktion med aminosyror, men deltar i samordningen av tre metalljoner belägna i LEM3: s aktiva centrum, på samma plats som i LEM-strukturen, och samordnas av samma rester DLEM3, DLEM3 och Dlem3, Dlem3 och GLEM3 Fig. Det är anmärkningsvärt att I m2-koordinationen ersätts vattenmolekylen med en syreatom som tillhandahålls av en grupp fosfodister av fosfokolinfragmentet.

Dessutom kan en tredje metalljon M3 placeras i elektrondensiteten, som samordnas av ytterligare DLEM3 och DLEM3. Substitutionen av dlem3 med alanin har en liknande skadlig effekt av den lnab frukost effektiviteten hos LEM3, som en mutation av aspartatresterna som samordnar M1 och M2, vilket antyder att närvaron av en metalljon vid m3-positionen är nödvändig för korrekt deforokolinering av LEM3 Fig.

Vid bindning till RAB1B-proteinsubstratet genomgår LEM endast mindre konformationsförändringar, utöver figuren.vilket leder till en utvidgning av den ihåliga regionen som ligger vid basen av kärnan i X-bladets klyfta mellan näven och tummen. Den grundläggande strukturen för Rab1b i komplexet är nästan identisk med den oberoende Rab1b Fig. Rab1b stöder faktiskt en typisk gtpas-fold med xnx1-xnx6rab1b som bildar ett centralt sexsträngat XNX-ark omgivet av fem XNX-backs xnx1-A5RAB1B.

RAB1B: GDP binder till den ihåliga regionen av LEM tillsammans med de redan närvarande XNX-kedjorna xnxlem3 och xnxlem3, det bildar en ny 6-cell intermolekylär ytterligare XNX-ark. Som ett resultat matar omkopplingsregionen II ut RAB1B från kärnan. Lnab frukost flyttar fosfokoliniserad T76RAB1B till det aktiva centrumet av LEM3, vilket leder till fosfodiestergruppens närhet till en samordnad jonjonplats.

Fig. De polära interaktionerna är huvudsakligen begränsade till väte-kedjan av väte, ytterligare siffror. Två fenylalaninrester från LEM3 och en från Rab1b utgör grunden för alla tre hydrofobiska fläckar. FLEM3 upptar y78rab1b-positionen, som ligger i en hydrofob ficka i RAB1B-APO-strukturen. Som ett resultat av detta förskjuts Y78rab1b av 9. Detta gör det möjligt för fosfokoliniserad T76Rab1b att närma sig metalljoner och följaktligen det aktiva centrumet i LEM3.

Aminosyrorna LEM3 som är involverade i denna ficka förskjuts med 2. Eftersom LEM3 också kan bilda komplex med Rab35 undersökte vi om de viktigaste interagerande resterna av Rab1b bevaras vid defophocholinering av Rab med hjälp av ett lokalt substrat som omformar omkopplingsregionen II, genomgår strukturell ombyggnad i komplexbildning med Lem3. Medelvärdena för XXL representerar tre oberoende biologiska upprepningar av oparade bilaterala t-tester.

Värdena för P från topp till botten för D är mindre än 0. Fullstor bild för att ytterligare verifiera den komplexa kristallstrukturen, vi undersökte effekten av utvalda alaninsubstitutioner i HPI-III med användning av defokolineringskinetik nya filmer nyårsdagen från MS.medan yalem3 är 0. Den katalytiska effektiviteten för den starka effekten av R69Arab1b på den katalytiska effektiviteten hos LEM3 observerades för Galem3, ingen av de lnab frukost nämnda mutanterna visar någon effekt på proteinstabiliteten i NanoDSF-mätningar.

Ytterligare fikon. Ytterligare fig. RAB1B II-omkopplaren är ett viktigt element i LEM3-igenkänning. Dessutom ersätts argininresten, som är viktig för bindningen av fosfater i ppm-fosfataser, funktionellt i LEM3 av leucin för att binda trippelmetylerad kvartär ammonium i Kolin. Diskussion här presenterar vi strukturerna av lnab frukost defosphocholinas LEM3 i sin apo-form och i komplex med sitt humana substratprotein RAB1B.

LEM3 visar ett högt strukturellt förhållande till PPM-fosfataser. Följaktligen kan den evolutionärt konservativa PPM-ramen fungera som en mall för olika reaktioner som katalyseras av denna grupp av proteiner. Vår kovalenta infångningsmetod med tiol-reaktiva substratderivat kan tjäna som grund för analys av andra ppm-fosfatasliknande proteiner, deras substratinteraktioner och grundläggande katalytiska mekanismer.

Eftersom det finns få strukturella data tillgängliga för substratigenkänning av PPM-fosfataser och för SIDD, ger vi inte värdefull inblick i hur fosfataser känner igen deras substrat. Även om det katalyserar hydrolysen av en fosfodiesterbindning istället för en fosfomonoester, är det typiska ppm-katalytiska centrumet mycket bevarat i LEM3 och därför är en liknande katalytisk mekanism som föreslagits för PPM-fosfataser sannolikt, som visas för PPM1A, LEM3 binder två metaller till dess apo-tillstånd, medan tre joner metaller observeras i närvaro av koordinering av joner av substratmetaller, utförda av en uppsättning mycket konserverade aspartatrester.

Även om vi har kristalliserat ett komplex med en hydrolysbrist på grund av s76t-mutationen i Rab1b, kan strukturen i LEM3:Rab1b-kristallcentret användas för att analysera det aktiva centrumet. Kristallstrukturen i LEM3: Rab1b indikerar en katalytisk mekanism som involverar tre lnab frukost och två vattenmolekyler. Vi antar att vattenmolekylen i Jon-dipolinteraktionen med M1 och M2 utför en nukleofil i attacken av SN2 P-typen på fosforatomen.

Den molekylära grunden för LEM3 som utför defosforylering, men kampen mot defosforylering kan delvis förklaras av den komplexa strukturen: L68Lem3333). och TLEM3 introducerar hydrofoba kontakter i kolingruppen i det bundna fosfokolinfragmentet. Fig. Tydligen är den hydrofoba interaktionen mellan kolingruppen och L68Lem3 viktig för defophocholination, eftersom mutation till alanin och arginin leder till en starkt reducerad aktivitet jämfört med WT Fig.

Mutationen till arginin omvandlar emellertid inte LEM3 till ett mer effektivt fosfat, även om mutationen ökar till arginin. till proteinets stabilitet. Byte av l68lem33 med alanin leder tvärtom till ett mindre stabilt protein, vilket indikerar en viktig funktionell roll. Förutom L68LEM3 bidrar TLEM3 också till bindningen av kolingruppen.

Därför föreslår vi att dessa positioner i PPM - liknande proteiner kan bidra till specificitet för olika PTM. Tyvärr förklarar strukturen inte LEM3S preferens för Serin-PC framför treonin-PC. Den biologiska betydelsen kan vara diskrimineringen mellan de två Rab Gtpaserna Rab1b och Rab35 under infektion, att båda blir modifierade ANKX i serin respektive treonin, förutom den katalytiska domänen tillhandahåller vi också strukturen för den C-terminala delen av LEM3, bestående av sju spiraler som bildar ett paket.

Det har visats att den hydrofoba slingan inuti den C-terminala spiralbunten av SIDD är ansvarig för membranlokalisering på Golgi-apparaten 36, eftersom SIDD också riktar sig mot RAB1 under lnab frukost, föreslår vi att den C-terminala delen av LEM3 kan ha en liknande funktion och är ansvarig för LEM3-lokalisering nära sitt målprotein. Den motsvarande hydrofobiska slingan kan emellertid inte identifieras i LEM3.

Kristallstrukturen i det fångade LEM3: Rab1b-komplexet ger insikt i interaktionen mellan PPM-fosfatas och dess substratprotein. Även om en komplex hydrolysbrist struktur inte kan representera ett aktivt enzymatiskt tillstånd på grund av lem3: s oförmåga att klyva treonin-PK-bindningar, tyder våra data på att den komplexa strukturen representerar en ögonblicksbild av den faktiska komplexa bindningshändelsen av RAB1B av LEM3.

Hittills finns det bara en PPM i komplex med en cyklisk fosforylerad peptid som ger grundläggande orienteringsinformation vid det katalytiska centrumet, vår struktur ger bevis för att enskilda regioner av PPM-fosfataser förmedlar substratspecificitet. Den strukturella jämförelsen visar, med ett undantag, att alla analyserade ppm-fosfataser innehåller en strukturellt konserverad positivt laddad aminosyra som interagerar med en fosfatgrupp.

I LEM3 och SIDD upptas emellertid en ekvivalent lnab frukost av leucin eller fenylalanin, som är ansvariga för bindning av kolin-respektive AMP-Egenskaper, vi antar att denna position är avgörande för den katalytiska specificiteten hos PPM, ett liknande, liknande format enzym. Vårt komplex bekräftar också hypotesen att den tredje metalljonen som krävs för hydrolytisk klyvning av fosfodiester också ger en metodologisk grund för att fånga och studera ppm-fosfatasubstratkomplex med lämpliga ATP-analoger, vilket leder till reaktiv fosforylering cysteinproteinet i substratet.

Förmodligen försämrar bristen på experimentella atomstrukturer i övergångsproteinkomplex Lnab frukost s förmåga att övervinna dessa problem. Detta argument gäller också det faktum att proteinkomplex av bakteriella effektorer och värdfaktorer är knappa som utbildningsmaterial för AF2. Dessutom, även om de grundläggande strukturerna för små G-proteiner kan modelleras på ett tillförlitligt sätt, misslyckas AF2 med att förutsäga de olika konformationstillstånden i växlingsregionerna på grund av överrepresentationen av det vikta GTP-tillståndet i proteindatabanken.

AF2 kan därför förmodligen inte modellera olika konformationstillstånd, särskilt för ett komplext gränssnitt.Följaktligen är vår kovalenta fångstmetod särskilt överlägsen de senaste modelleringsmetoderna när man överväger övergångskomplex och komplex med strukturella omarrangemang vid gränssnittet. En jämförelse av strukturen och de funktionella experimenten bekräftar att en konformationsförändring i switch II orsakad av införandet av en hydrofob XX-kanin i den hydrofobiska kärnan i Rab1b är nödvändig för defophocholination.

Detta resultat ger en förklaring till att LEM3 visar en preferens för ett inaktivt tillstånd som är associerat med BNP. Y77Rab1b är belägen i LEM3S ihåliga område, vilket ger tillräckligt med utrymme för förstärkarfragmentet. Det finns funktionella likheter i LEM3-åtgärden jämfört med ANKX. Liksom FLEM3 på X-håret, ersätter Y78RAB1B i RAB1B-kärnan under katalys, använder ANKX också ett hydrofobiskt piercingelement för att förskjuta samma tyrosin, och därmed utvecklas och flytta switch II-regionen.

Således är den kovalenta fångsten av LEM3: Rab1b-komplexet, i kombination med strukturbestämning, avslöjade en lokal mekanism för Rab1b-utveckling med hjälp av LEM3 och ger insikt i måligenkänning av bundna PPM-fosfataser. Detta tillvägagångssätt kan fungera som en mall för att karakterisera övergångsproteinkomplex i allmänhet. Metoderna för ANKX-plasmidkonstruktionen som används i denna publikation beskrivs tidigare i